Som Gustav Vasas näst äldste son blev Johan III hertig över västra Finland 1556 och i den egenskapen förde han en självständig politik som bland annat gick ut på att få kontroll över Estland och förvandla det till en egen stat utanför Sveriges gränser. Dessa planer stoppades 1561 av brodern Erik XIV som hade blivit kung året innan. Estland annekterades då för Sveriges räkning och Johans makt över sitt hertigdöme begränsades genom ett riksdagsbeslut. När Johan trots allt fortsatte sin självständiga politik genom att gifta sig med den polska prinsessan Katerina Jagellonica fick Erik XIV nog. Johan dömdes till döden av riksdagen och soldater skickades till Finland 1563 för att inta Johans slott i Åbo. Han hölls sedan fången i Gripsholms slott fram till hösten 1567 då Erik XIV:s sinnesjukdom hade brutit ut och riksrådet som styrde i hans ställe beslutade att frige Johan.

Sommaren 1568 ledde Johan ett framgångsrikt uppror mot Erik XIV som stöddes av högadeln och den yngre brodern hertig Karl. Samma år hyllades Johan som ny kung och han belönades högadeln och hertig Karl med utökade privilegier och maktbefogenheter. Johan III:s regeringstid kom därefter att präglas av en maktkamp mellan kungen, hertig Karl och högadeln som representerades av riksrådet. I början samarbetade kungen och riksrådet mot hertig Karl för att förhindra att hans makt utökades. Johan III:s politik som gick ut på att styra utan riksrådets inblandning ledde dock till en brytning med detta och till att Johan började samverka med hertig Karl istället.

Sveriges krig mot Polen slutade som en direkt följd av att Johan III blev kung och 1570 slöts fred med Danmark och Lybeck. Men omedelbart efter freden bröt krig ut med Ryssland och detta skulle pågå fram tills efter Johan III:s död. På grund av det ryska kriget odlade han sin vänskap med Polen och 1573 och 1575 försökte Johan III utan framgång att bli vald till polsk kung. Men 1587 fick han sin son Sigismund vald till kung av Polen.

Det Johan III annars är mest känd för är hans försök att driva den svenska kyrkan mot katolsk riktning. Johan III var intresserad av teologi och önskade ett närmande mellan de katolska och protestantiska kyrkorna. Men detta var dock impopulärt i Sverige där protestantismen hade rotat sig och efter hans död 1592 revs reformerna upp.

Johan III efterträddes av sin son Sigismund.